Ранньовесняна діагностика фітопатогенів польових культур новими методами

471
Ранньовесняна діагностика фітопатогенів польових культур молекулярними методами

При всій повазі до агрономічного досвіду наших читачів важко не погодитись, що діагностика неозброєним оком сьогодні безумовно програє новітнім методам виявлення збудників хвороб на рівні ДНК. Метод, який донедавна використовували виключно в медицині та криміналістиці, сьогодні доступний і в сільському господарстві.

Найбільш поширеними та шкодочинними хворобами зернових колосових культур в Україні є борошниста роса, снігова пліснява, тифульоз, бура й жовта іржа злаків, сажкові хвороби, септоріоз, фузаріоз колосу та кореневі гнилі. Їх шкодочинність варіює з року в рік і залежить переважно від погодних умов, загального стану рослин, рівня мінерального живлення, попередника, густоти стояння рослин, сортових особливостей тощо. Комплекс хвороб уражує рослини на всіх етапах їх розвитку, особливо після відновлення вегетації озимими культурами навесні. Через дію низки негативних екологічних чинників (коливання температур, підмерзання, підсихання, хлороз тощо) пригнічується ріст і розвиток рослин, а згодом на таких ослаблених рослинах поселяються різні мікроорганізми (гриби, бактерії та ін.), які зумовлюють розвиток патологічного процесу. В підсумку розвивається комплексне захворювання рослин, як-от кореневі гнилі.

Ранньовесняна діагностика фітопатогенів польових культур молекулярними методами 1

Діагностика згаданих вище хвороб значною мірою гальмує процес побудови правильних та ефективних систем захисту. Вирішення цих питань ускладнюється ще й тим, що під загальною назвою «кореневі гнилі», крім церкоспорельозу (збудники Helgardia herpotrichoides (Fron) Crous & W. Gams і H. acuformis (Nirenberg) Crous T. Gams) та офіобольозу (збудник Gaeumannomyces graminis (Sacc.) von Arx & Olivier var. tritici Walker), розглядалися ще чотири хвороби: побуріння основи стебла, або фузаріоз (збудники – гриби роду Fusarium Link), фузаріозна коренева гниль (збудники ті ж самі); звичайна, або гельмінтоспоріозна коренева гниль (збудник Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker) та ризоктоніоз (збудник Rhizoctonia cerealis Van der Hoeven). Усі шість хвороб мають подібні симптоми, тому розрізнити їх візуально майже неможливо.

Для ефективного застосування засобів захисту рослин від хвороб і контролю зараженості фітопатогенними грибами на різних стадіях розвитку рослинного організму необхідні детекція і точна ідентифікація збудників захворювання. У польових умовах діагностування хвороб, викликаних фітопатогенними грибами, проводять за наявністю визначених ознак захворювань рослин, а в лабораторних умовах ідентифікацію збудника здійснюють за морфологією спор та іншими ознаками патогену з використанням методів мікроскопії й культивування грибів на поживних середовищах.

ДіагностикаОднак морфологічні характеристики спор і міцелію грибів у близько­споріднених видів часто можуть збігатися, крім того, відзначено їх широкий поліморфізм у межах виду. До того ж рослини можуть одночасно уражуватися й іншими патогенами, що призводить до спотворення симптомів проявів хвороби. З огляду на це актуальним є застосування більш чутливих методів діагностики. Останніми роками для детекції та ідентифікації фітопатогенних мікроорганізмів використовують як молекулярно-генетичні методи, так і методи класичної фітопатологічної експертизи.

КЛАСИЧНІ МЕТОДИ ДІАГНОСТИКИ І ТРУДНОЩІ В ЇХ ЗАСТОСУВАННІ

Ідентифікація фітопатогенних грибів вкрай важлива, однак постає запитання: яким чином вона проводиться?

Найпростіший спосіб – ідентифікація патогена за зовнішніми ознаками захворювання (симптомами), тобто за його впливом на уражену рослину. Проте проблема в тому, що одні й ті ж самі пошкодження рослини-господаря можуть викликати зовсім різні мікроорганізми, які відрізняються різною стійкістю до фунгіцидів, шкодочинністю та іншими характеристиками. Як приклад можна навести три листові плямистості пшениці (рис. 1).

Рис. 1. Листові плямистості пшениці. Зліва – септоріоз листя пшениці (збудник Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schrot). В центрі – септоріоз листя та колосу пшениці, прояв на листках (збудник Phaeosphaeria nodorum (Е. Mll) Hedjar). Справа – жовта плямистість пшениці (збудник Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechsler). Незважаючи на те, що це різні захворювання, ураження листя дуже схожі
Рис. 1. Листові плямистості пшениці. Зліва – септоріоз листя пшениці (збудник Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schrot). В центрі – септоріоз листя та колосу пшениці, прояв на листках (збудник Phaeosphaeria nodorum (Е. Mll) Hedjar). Справа – жовта плямистість пшениці (збудник Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechsler). Незважаючи на те, що це різні захворювання, ураження листя дуже схожі

Ще одна проблема полягає в тому, що далеко не всі захворювання проявляються відразу ж після зараження рослини. Це так званні латентні, приховані інфекції, коли тривалий час або й впродовж усього свого життя рослина хворіє без зовнішніх ознак (вірусні хвороби за певних екологічних умов, летюча сажка пшениці, ячменю до фази колосіння та ін.). Наприклад, збудник летючої сажки ячменю (Ustilago nuda (C.N. Jensen) Kellerm. & Swingle) зазвичай проникає під час його цвітіння. Гриб не перешкоджає формуванню зародка, саме зерно розвивається нормально, нічим зовні не відрізняючись від здорового. Гриб зберігається у вигляді міцелію, а при проростанні насіння проникає у проростки. У травні-червні спори, які пиляться із хворих колосків, заражають зав’язь здорових рослин. Водночас руйнуються всі частини колоса, перетворюючись на чорну спорову масу, після розпилення якої залишаються лише ості та стрижень колоса.

Стандартний для фітопатологів підхід при визначенні фітопатогенних грибів –  виділення їх у чисту культуру на будь-якому живильному середовищі, отримання характерних утворень (найчастіше це спороношення) і надалі ідентифікація методом світлової мікроскопії.

Однак тут виникають певні труднощі. Основна з них полягає в тому, що не всі паразитичні гриби культивуються на штучних поживних середовищах: деяким із них потрібна наявність живих тканин рослини-господаря або ж специфічних регуляторів росту. Але навіть якщо гриб вдається виділити в культуру, виникає наступне питання: скільки часу знадобиться для появи спороношення? Наприклад, збудник білосолом’яної гнилі пшениці та жита (Gibellina cerealis Pass.), хоч і добре культивується, дає спороношення тільки після чотирьох-п’яти тижнів росту.

Рис. 2. Порівняння конідій типових зразків Alternaria longipes (Ellis & Everh.) E.W. Mason (вгорі), Alternaria godetiae (Neerg.) Neerg. (в центрі), Alternaria alternata (Fr.) Keissl. (внизу). Видно, що на основі порівняння тільки форми конідій цих трьох видів однозначно розрізнити їх вкрай складно. При ідентифікації видів у цьому випадку фахівець використовує не тільки форму конідій, а й інші ознаки, наприклад, спосіб їх утворення, взаємне розташування тощо
Рис. 2. Порівняння конідій типових зразків Alternaria longipes (Ellis & Everh.) E.W. Mason (вгорі), Alternaria godetiae (Neerg.) Neerg. (в центрі), Alternaria alternata (Fr.) Keissl. (внизу). Видно, що на основі порівняння тільки форми конідій цих трьох видів однозначно розрізнити їх вкрай складно. При ідентифікації видів у цьому випадку фахівець використовує не тільки форму конідій, а й інші ознаки, наприклад, спосіб їх утворення, взаємне розташування тощо

Зрозуміло, що заходи боротьби з патогеном необхідно вживати відразу після його виявлення, а не через місяць, коли з’ясується, що рятувати вже нічого. І навіть із визначенням тих фітопатогенних грибів, спороношення яких отримати порівняно просто, можуть виникати складнощі.

Наприклад, ідентифікація багатьох мікроміцетів пов’язана з низкою труднощів, таких як схожість морфологічних характеристик різних видів і водночас внутрішньовидова варіабельність ознак. Незважаючи на зовнішню схожість, збудники можуть значно відрізнятися за патогенністю, токсичністю, ступенем спеціалізації, генетикою відносин із рослиною-господарем, шкодочинністю, чутливістю до фунгіцидів тощо.

Тобто різні види мають абсолютно різні екологічні потреби та господарську значимість.

Яскравим прикладом тут є визначення різних видів роду Alternaria (рис. 2). Очевидно, що для ідентифікації виду потрібні досить широкі знання в цій галузі та чималий досвід роботи з досліджування фітопатогенів.

ІННОВАЦІЙНІ МОЛЕКУЛЯРНО-БІОЛОГІЧНІ ТЕХНОЛОГІЇ ДІАГНОСТИКИ ПАТОГЕНІВ

Ще два десятиліття тому методи діагностики інфекцій у рослин були досить трудомісткими і займали багато часу. Використання рослин-індикаторів для ідентифікації вірусів, застосування спеціальних середовищ для виявлення бактерій та інші традиційні методи аналізу займали дні, а в деяких випадках – тижні й навіть місяці.

Сучасний метод високоефективного тестування патогенів, у тому числі й фітопатогенів, заснований на полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). Простота, висока чутливість і специфічність, хороша відтворюваність результатів аналізів швидко перетворили цей підхід на один із найперспективніших діагностичних методів. На відміну від традиційних і серологічних методів аналізу, що дають тільки опосередковане свідчення наявності інфекції (наприклад, відомості про наявність білків-антигенів діагностованих патогенів), метод ПЛР безпосередньо доводить присутність збудника інфекції, специфічно визначаючи наявність конкретної послідовності нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) виявленого патогена. Крім того, метод ПЛР завдяки своїй високій чутливості дає змогу встановити поодинокі копії геномів патогенів, водночас визначаючи їх наявність тоді, коли іншими методами (імунологічний, бактеріологічний, мікроскопічний) це зробити практично неможливо.

Читати по темі: Сучасні фунгіциди у захисті зернових культур

Особливо ефективний метод ПЛР для діагностики важко культивованих, не культивованих і приховано існуючих форм мікроорганізмів, з якими часто доводиться стикатися при латентних і хронічних інфекціях. ПЛР-технології, як правило, дають змогу уникнути складнощів, пов’язаних із вирощуванням таких мікроорганізмів у лабораторних умовах. Крім того, завдяки використанню методу ПЛР вдається значно скоротити час аналізу зразка. Для прикладу: фітопатологічний аналіз рослинного матеріалу передбачає 10–14 днів лабораторної експертизи, тоді як отримати результати ПЛР-діагностики можна впродовж 2 робочих днів.

Хоча переваги і перспективи використання молекулярних методів ідентифікації складно переоцінити, на шляху їх практичного застосування виникає чимало труднощів. Незважаючи на універсальність методів при кінцевому аналізі, для їх розробки та перевірки потрібно мати досить багато часу і чималу експериментальну базу. Діагностичні центри ТОВ «Сингента» в рамках технічної програми «АгроГід» уже не перший рік надають клієнтам компанії унікальну можливість використовувати ПЛР-діагностику для вирішення проблем ідентифікації фітопатогенів. Досить часто виникають проблеми, пов’язані з необхідністю швидкого визначення етіології симптомів. Це можуть бути як ранні етапи розвитку хвороб, так і фізіологічні реакції рослин на вплив погодних умов, незбалансоване живлення чи прояв фітотоксичності.

Для того щоб скористатися сервісом, необхідно відібрати зразок рослинного матеріалу й у максимально короткий час відправити його до Білоцерківського діагностичного центру, де фахівці лабораторії проведуть аналіз і нададуть вам протокол результатів із рекомендаціями.

Для правильного відбору матеріалу використовуйте спеціально розроблені Рекомендації з відбору зразків для діагностичних центрів та користуйтеся брендованими пакетами «АгроГід» для рослинного матеріалу, які вам може надати менеджер із продажів компанії «Сингента» у вашому регіоні.

Відсутність симптомів ураження – не привід вважати ситуацію в полі контрольованою, а от планування та проведення фітопатологічної експертизи рослин, у тому числі з застосуванням ДНК-тестування особливо небезпечних для культур збудників, дадуть можливість бути впевненими в очікуваному врожаї.

Юлія Шевченко, керівник діагностичних центрів, Олег Грицев, спеціаліст Білоцерківського діагностичного центру

Опубліковано в журналі “Агроном”, 2020

Найсвіжіші матеріали читайте в журналі «Агроном». Слідкуйте за головними агрономічними новинами на нашій сторінці у Facebook та каналі в Telegram